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中國網/中國發展門戶網訊 工程細胞是綠色生物制造的“芯片”，在醫藥、化學品、材料、燃料等各類物質的生物加工過程中充當核心執行者角色。目前，工程細胞的構建往往依托設計—構建—測試—學習（DBTL）循環策略，首先基于先驗知識和計算模型設計生物合成路徑，利用基因合成、組中醫診所設計裝和編輯等技術進行工程細胞的構建，進而對所構建工程細胞進行測試，如基因型測試，以及包括細胞生長、目標產物產量和質量在內的表型測試，最后對測試結果進行綜合評估分析，用于進一步優化設計，提高工程細胞工作效率。由于生命系統的復雜性，人們對代謝網絡和多層次調控機制認知有限，往往需要構建海量基因型進行大規模表型測試，才能獲得性能優越的工程細胞底盤。因此，在DBTL循環中，工程細胞的高通量表型測試是最為關鍵的環節之一。
儀器設備是實現工程細胞高通量表型測試的基礎。縱觀工程細胞表型測試技術與裝備發展歷程，經歷了平板、微孔板、自動化工作站和微流控4個階段。19世紀80年代，為了解決試管或燒瓶中單克隆難以觀察和操作的問題，德國微生物學家Julius Richard Petri發明了Petri平板培養皿，開啟了平板測試時代，這種用于單克隆分離培養的平板技術沿用至今。隨著測試通量需求的提高，20世紀50年代，德國微生物學家Gyula Takatsy發明了微孔板測試方法，集成單克隆培養與檢測，通量一般為103/天—104/天。由于微孔板操作耗時耗力，20世紀80年代，自動化工作站時代到來，并在后期逐漸形成集成克隆挑取、孔板培養、檢測、篩選自動化操作模塊于一體的集成平臺，每天實現104—105樣品高通量測試。20世紀90年代，Manz等首次提到微流控這一詞匯，定義為一種在微納米尺度空間中精確控制和操縱微納米流體的科學技術。21世紀初，微流控技術迎來迅猛發展，由于樣品操作體積小、檢測參數多樣（如熒光、散射光、吸光度、拉曼）、檢測通量高（每天測試樣品最高達到108—109）、成本低（試劑消耗比微孔板降低可達106倍）等巨大優勢，微流控裝備成為工程細胞高通量表型測試研究熱點。面向合成生物學單細胞分析與高通量篩選等表型測試需求，近年來發展了非培養類型的單細胞測試、培養類型的液滴微流控測試與微腔室測試技術與裝備，為合成生物學的發展提供了重要的裝備支撐。總的來說，微流控技術的應用，代表了工程細胞表型測試技術與裝備高通量、自動化、微型化、集成化、多參數的發展趨勢。本文將重點闡述基于微流控技術的非培養類型與培養類型工程細胞高通量表型測試技術與裝備研究進展，并展望其發展方向，為面向綠色生物制造的工程細胞表型測試提供借鑒。
單細胞高通量表型測試技術與裝備
單細胞表型測試技術是指基于單細胞自身特性如光學性質、胞內代謝產物、形狀特征、毒性耐受、電學性質等的檢測與分選技術。通過散射光與熒光、質譜信號、拉曼光譜、顯微成像、磁信號等技術識別目標細胞信息后，利用電場、磁場、光場、聲場、流體力場、重力場等方法驅動細胞向收集處運動，最終分選出目標單細胞。下文對4類典型的單細胞表型測試技術與裝備進行總結。
熒光激活細胞分選技術與裝備
熒光激活細胞分選（fluorescence activated cell sorting，FACS）是對熒光標記的單細胞進行高速、多參數定量分析和分選的技術（圖1a），由控制細胞流動的流體系統、光學系統、捕獲發射熒光和散射信號的電子系統和數據采樂齡住宅設計集系統組成。其原理是利用激光作為光源照射單細胞產生散射光和熒光信號，并將這些光學信號通過檢測器讀取、轉換為電子信號輸出，從而對單個細胞進行快速分析和篩選。
FACS技術用于熒光標記的單細胞高通量測試，每天測試通量可達到108以上。近年來，基于熒光探針、細胞表面展示、生物傳感器等熒光標記技術，FACS在蛋白質工程和工業菌株育種領域取得顯著進展，例如纖維素酶等定向進化，高產Lloft風室內設計-半胱氨酸大腸桿菌、高產L-賴氨酸谷氨酸棒狀桿菌等典型工業菌株的高通量選育。然而，FACS單細胞表型測試技術受限于熒光標簽的開發，以及胞內與胞膜物質的測試，同時流式細胞儀細胞分選前的高壓充電過程和分選過程中的高速噴射過程均對細胞產生一定損傷，致使活力下降。為了避免這些問題，研究者開發了雙乳化水包油包水液滴（W/O/W）、凝膠微球（gel-droplet）等技術，將單細胞包裹進水相液滴或水相微球中進行后續培養和FACS篩選。然而，這些方法由于步驟煩瑣、液滴易破損未得以廣泛應用。
FACS技術裝備化方面，近年來，我國上海緯冉科技有限公司自主研發的SE420流式細胞分選儀實現了細胞樣本的全面分析與高通量分選，成都賽雷納醫療科技有限公司研發的小型Sparrow流式細胞儀以及深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司的BriCyte E6流式細胞儀，目前一般用于單細胞的分析與檢測。在進口品牌方面，美國BD公司的FACS Calibur、FACS Melody、FACS Jazz、FACS Aria系列，美國Beckman Coulter公司的CytoFlex SRT、EPIC XL系列，日本On-chip Biotechnologies公司的On-chip Sort細胞分選儀均可進行多參數、高分辨率和靈敏度細胞分析與分選。可見我國FACS整體技術水平與國外仍有差距，在市場認可度、儀器檢測精度、靈敏度、穩定性及多參數檢測能力等方面有待提高。因此，需不斷加強基礎研究和技術創新，加大對關鍵零部件研發的投入，提高儀器的核心性能和自主可控性，加速技術轉化和人才培養，提升我國在流式細胞術領域的整體技術水平。
拉曼激活細胞分選技術與裝備
拉曼激活細胞分選（Raman activated cell sorting，RACS）是基于拉曼光譜檢測的單細胞分析和分選技術（圖1b）。拉曼光譜是一種散射光譜，每個散射峰都對應于一種特定的分子鍵振動，因此可以識別單細胞內部的全景信息，允許對單個細胞進行無損、無標記的化學分析，并根據其分子組成進行物理分選，被視為一種快速、低成本的單細胞表型測試技術。根據分選時單細胞的運動狀態，RACS測試分為靜態細胞分析與捕獲、流動細胞分析與捕獲2種類型。前者是指在細胞靜止或相對靜止的狀態下，基于拉曼光譜信息分選出特定類型細胞至單管中，如拉曼彈射分選（Raman-activated cell ejection，RACE）、重力驅動拉綠設計師曼光鑷液滴分選（Raman-activated gravity-driven encapsulation，RAGE）等技術，其優勢為可以對接下游的單細胞培養、單細胞測序等研究，然而靜態單點捕獲通量過低。后者是指細胞懸浮在流動相中，在流動狀態下對單細胞進行拉曼光譜檢測，分選收集優勢表型細胞，如拉曼微液滴分選（Raman-activated droplet sorting，RADS）、介電捕獲拉曼激活液滴分選（positive dielectrophoresis-based RADS，pDEP-RADS）等技術，單細胞在拉曼檢測后隨著流動相流動，通過油相剪切形成單細胞液滴進而分選至收集管，其優勢為高通量，更適用于文庫中目標表型細胞的測試。
RACS靜態單細胞測試技術主要應用于單細胞組學研究，Song等利用該技術從海水樣品中分離出富含類胡蘿卜素單細胞，并在分離后對單細胞進行測序，發客變設計現了新型類胡蘿卜素合成基因；Su等通過對分離的單細胞全基因組擴增測序，實現了95%的基因組覆蓋度。而RACS流動單細胞測試技術主要應用于單細胞底物代謝、產物合成和細胞的分析鑒定研究，通量每天可達到104以上。在細胞代謝測試中，通過使用13C、15N和2H等同位素標記底物從而改變分子質量，細胞攝入底物侘寂風后，拉曼光譜發生變化，實現細胞代謝的分析研究。例如，Kumar等將13C標記的糖類物質等添加到底盤細胞培養基中，通過分析蛋白中13C拉曼光譜位移變化，揭示了細胞對碳源底物代謝的抑制機制。在胞內產物合成測試中，拉曼光譜可以在無損且非標記的狀態下同步檢測不同代謝產物，如色素、淀粉等物質，為高產菌株的高通量篩選和定量分析提供新思路。此外，由于每種單細胞拉曼光譜具有特異性，可作為單細胞特有的“分子指紋圖”，進而反映出特定細胞內化學物質成分及含量的多維信息。因此，RACS還被用于單細胞分析鑒定，如Yan等結合機器學習算法和拉曼光譜，在單細胞水平上鑒定出食源性病原體。
我國拉曼光譜單細胞表型測試裝備處于國際領跑地位。青島星賽生物科技有限公司率先開發了全球首臺高通量流式拉曼分選儀FlowRACS，該裝備能夠直接鑒定單細胞種類并測試代謝相關表型。吉林長光辰英科技有限公司開發了PRECI SCS-R300拉曼單細胞分選儀，實現了單細胞識別與分離研究。
圖像激活細胞分選技術與裝備
圖像激活細胞分選（image activated cell sorting，IACS）是一種基于顯微成像的細胞分選技術（圖1c）。IACS技術的核心在于利用高分辨率顯微成像系統捕獲細胞的圖像，然后通過圖像分析軟件識別和分類細胞。這些圖像可以提民生社區室內設計供細胞的大小、形狀、紋理等信息，常用于特定細胞的高通量分離實驗。例如，Nitta等將三維成像技術和薄膜微閥流體驅動技術結合，獲取高質量的細胞三維圖像，并通過薄膜閥驅動目標細胞至收集管路中，以此完成細胞的圖像分析和分選。Akihiro等基于IACS身心診所設計技術，集成了高通量的光學顯微鏡、細胞聚焦、細胞排序和深度學習算法，開發了iIACS系統，實現了數據采集、處理、智能決策和執行的自動化操作。Zhao等將iIACS系統與人工智能（AI）圖像處理結合，進一步提高了基于圖像的單細胞分選通量。
基于IACS技術研發的裝備包括美國BD公司的ImageStream X MkII系統、美國Amnis Corporation 公司的ImageStream系統、美國Beckman Coulter 公司的CytoFLEX系列產品，實現了分選前的細胞圖像信息采集。我國青島星賽生物科技有限公司開發了EasySort AUTO系統，基于顯微成像與AI圖像分析技術，在該系統中，AI輔助目標檢測模型實現了對目標細胞的高精度識別，系統集成的光鑷模塊能夠將細胞自動轉移到收集管中。目前，我國在IACS領域的研究發展迅速，但由于起步較晚，還處于基礎技術的開發和優化階段。因此，需要加強基礎研究、促進跨學科合作與國際合作交流，以逐步縮小我國IACS裝備與國際先進水平的差距。
磁激活細胞分選技術與裝備
磁激活細胞分選技術 （magnetic activated cell sorting，MACS）是一種基于磁場和磁性標記的細胞分離技術（圖1d），其核心在于使用超順磁性微珠標記特異性抗體，這些抗體能夠識別并結合目標細胞表面的特定抗原，一旦標空間心理學記完成，細胞混合物被引入磁場中，磁性微珠會被迅速吸附到磁場的一側，從而將標記的細胞與未標記的細胞分離，其通量為每天109樣品。MACS分離方式快速、高效，且對細胞的損傷小，適合于后續的細胞培養、分子分析，常用于動物細胞的分離。Munz等利用MACS技術成功分離小鼠脾細胞中的樹突狀細胞（DCs），并研究了其在免疫應答中的作用。然而，該技術面臨特異性抗體標記的問題，難以實現細胞的普適性測試。在裝備研究中，德國Miltenyi Biotec公司的AutoMACS、美國Thermo Fisher Sc綠裝修設計ientific公司的Dynabeads，均成功實現了磁激活細胞分選設備商業化。此外，美國BD公司將MACS與FACS技術結合，開發了FACSAria III產品，為用戶提供了更多的選擇。可見國內MACS裝備產業化程度相對較低，缺乏具有國際競爭力的品牌，因此需要投入更多資源進行MACS技術的基礎研究，以提升我國MACS技術創新能力。
基于FACS、RACS、IACS、MACS技術原理開發的非培養類型單細胞高通量表型測試典型商業化裝備如表1所示。
微液滴高通量培養技術與測試裝備
液滴微流控技術（droplet-based microfluidics）是一種在微納米尺度上操控和處理微液滴的技術，通過在微通道內操控互不相溶的多相流體，豪宅設計基于微流控芯片實現皮升（pL）至微升（μL）尺度液滴的單元操作，包括液滴的生成、注入、分裂、會所設計融合、信號檢測和分選等。與單細胞測試工具相比，液滴可以作為獨立的反應單元培養單細胞，并進行后續胞內、胞膜、胞外、無細胞體系相關物質的高通量檢測與分選，具有體積小、單分散性好、無交叉污染等優點。典型模式菌株如大腸桿菌、酵母菌等直徑在10微米以下，100皮升以內的液滴即可滿足培養需求；而動物細胞、放線菌等直徑在10微米以上，需要將液滴醫美診所設計體積增加至幾百皮升乃至納升級別才可以進行培養，絲狀真菌菌絲密集堅硬，在皮納升液滴中培養易造成液滴之間的融合，通常需要微升液滴體系才可長期培養。可見，不同表型測試場景下的液滴微反應器尺度需求不同，下文將分別闡述皮納升液滴與微升級液滴測試技術與裝備。
皮納升液滴培養技術與測試裝備
皮納升液滴是指體積范圍在1皮升—100納升的液滴，一般以油相作為連續相，水相作為分散相，當兩相流體經過毛細管共軸聚焦、微流控芯片流動聚焦等結構時，油相剪切水相形成均勻的單分散液滴。通過泊松分布理論，單細胞被包裹在液滴中進行生長代謝，隨后基于不同的分選技術，如熒光激活液滴分選（FADS）、吸光度激活液滴分選（AADS）、質譜激活液滴分選（MADS）、成像激活液滴分選（IADS）實現目標表型細胞的分選和收集。
FADS技術是目前使用最廣泛的皮納升液滴篩選技術（圖2a），最早于2009年被提出，經過10余年的發展，技術不斷迭代升級，已經形成較為成熟的商業化裝備。FADS技術由驅動系統、成像系統、光學系統、電學系統、微流控芯片系統等組成，通過微泵驅動液滴運動，激光器激發液滴熒光后，光學系統將光信號轉化新古典設計為電學信號輸出；當信號位于設定的閾值時，通過介電泳等方式將液滴分選至芯片收集通道。該技術中的關鍵挑戰在于開發熒光探針，實現熒光信號與細胞表型的耦合。針對細胞表達的生物酶活性測試，開發了熒光基團修飾底物檢測體系；針對小分子代謝物，開發了酶聯熒光探針傳感器、全細胞類與擬熒光蛋白類生物傳感器，極大拓展了FADS技術在合成生物制造領域的應用。
由于FADS技術需要開發相應的熒光檢測體系，在具體使用場景受到一定限制，近年來還發展了AADS、MADS、IADS等無標簽檢測分選技術。AADS技術是基于吸收光譜法的微液滴檢測技術（圖2b），Gielen等通過在液滴檢測口兩側，芯片上內置兩根光纖，分別連接光源和檢測器，液滴流過時引起光譜吸收變化輸出信號，根據光吸收變化對感興趣的目標液滴進行分選。該裝置用于苯丙氨酸脫氫酶的定向進化，酶活性增加了2.7倍。然而，由于皮納升體積液滴反應器檢測光程過短、檢出信號困難，AADS技術仍處于底層技術研究階段。MADS技術是將微流控芯片通過接口連接ESI電離噴霧質譜（圖2c），在微流控芯片上完成液滴的分裂，一部分液滴通過接口進入質譜進行破壞性檢測，另一部分液滴備份。當質譜輸出符合預期的信號時，基于介電泳將備份的液滴分選至芯片收集通道，該裝置用于含有體外表達轉氨酶的液滴篩選，實現了0.7個/秒的液滴篩選速率，準確率為98%。IADS技術是一種基于液滴圖像識別、處理與分析的無標記分選技術（圖2d），首先將細胞細胞懸浮液與試劑混合，進行單個細胞的封裝，在微環境中培養后通過顯微成像、熒光成像技術測試培養后的細胞群。Zang等通過對液滴成像，檢測液滴內放線菌的生長量，實現了100個/秒目標液滴的分選。
國內外報道了眾多基于FADS技術的商業化皮升納液滴裝備。我國洛陽華清天木生物科技有限公司開發了商業化的高通量皮升級液滴單細胞分選系統DREM cell，實現了每天超百萬液滴的篩選通量。Ma等基于該設備將酯酶對映體選擇性提高了700倍以上。Yu等通過在目標蛋白上添加四半胱氨酸，利用其與雙砷反應產生熒光信號，將分泌蛋白產量提高2.5倍以上。Li等通過構建液滴生成、注入、分選流程，結合生物傳感器，有效提高了目標小分子等代謝物的產量。DREMcellTHE R3 寓所還用于微生物培養組學研究，如蜜蜂腸道菌群培養、作物致病拮抗菌株的資源挖掘。英國Sphere Fluidics公司研制了納升級Cyto-Mine設備，液滴操作體積為0.健康住宅3納設計家豪宅升，是一款單細胞包裹、檢測、分選與克隆驗證集成于單一平臺的單細胞分析篩選儀器，常用于快速檢測單個細胞的外泌分子（如IgG、抗原）等，然后根據液滴熒光信號強度選擇特定的單細胞。此外，浙江達普生物技術有限公司的CytosparkTM MSP皮升級液滴系統、深圳華大基因股份有限公司MGIDS-1000P多功能液滴分選一體機、浙江墨卓生物科技有限公司的MobiNova-S1單細胞液滴分選儀、大連華微科技有限公司的HW-SeaBreeze X等均實現了皮納升液滴分選技術與裝備開發。上海濤烜科學儀器有限公司基于IADS技術研發了Hypercell高通量單細胞分選平臺，每天可測試105—106產生分泌物的目標單細胞。
微升級液滴培養技術與測試裝備
微升級液滴培養技術指的是基于微升級別體積的油包水液滴的單細胞培養和分選技術，每天可以完成104—105個樣本的測試。在培養方面，微升級液滴按序收集于透氣性管路中，管壁良好的氣體交換性能為細胞培養提供了硬件基礎。同時由于微升液滴比皮納升液滴體積更大，因此能夠支持更長時間、更多種類（放線菌、霉菌等大型細胞）的微生物培養，微生物濃度達到105 CFU/mL以上。在檢測與分選方面，微升級液滴可搭載吸光度、熒光、質譜等各種檢測方式，實現細胞的多表型測試。在分選方面，常規使用的電場、光鑷等難以產生足夠大的驅動力將液滴分選至收集通道。本文作者團隊開發了重力場驅動微升液滴至微孔板的分選與收集方法，形成了我國具有自主知識產權的微升液滴分選技術。
我國洛陽華清天木生物科技有限公司開發了商業化微生物微液滴培養系統MMC與高通量微升級液滴培養組學系統MISScell裝備。MMC系統主要用于微生物的連續進化研究，通過集成液滴識別、光譜檢測、微流控芯片和進樣模塊等功能，實現了對微生物液滴的精確操作，包括發生、培養、監測、分割、商業空間室內設計融合和分選等過程。MMC液滴體積為2—3微升，一批次產生200個液滴培養單元并可連續傳代15天以上，最終分選出具有顯著生長優勢的底盤細胞。MMC已成功應用于耐高濃度D-山梨醇和耐高溫Gluconobacter oxydans菌株、甲醇利用型大腸桿菌等菌株適應性進化。MISScell系統主要養生住宅用于單細胞高通量培養篩選研究，每批次生成約5 000個2微升單細胞液滴，液滴存儲在高透氣性管路中進行細胞培養（0—8天），通過光學信號（如光學密度、熒光等）檢測分選，搭載機械臂搬運孔板，一批次最多可以收集1 000株優良表型細胞。本文作者團隊使用帶有熒光標記的大腸桿菌驗證了MISScell基于泊松分布包裹單細胞的可行性，并利用該裝備實現了谷氨酸棒狀桿菌的高通量篩選，從502株突變體中分選出的優勢菌株谷氨酸產量提高了25%以上。此外，法國MilliDrop公司的Milidrop Analyzer液滴培養儀也是一款微升級液滴裝備，每批次可以生成102—103個細菌、酵母等單細胞微生物液滴，在追蹤細菌在不同抗生素壓力下的適應性進化、量化腸道細菌的多樣性等科學研究中得到應用。
基于FADS、AADS、MADS、IADS技術原理開發的培養類型高通量表型測試典型商業化液滴微流控裝備如表2所示。
微腔室高通量培養技術與測試裝備
微腔室反應器是指基于微加工技術在硅、玻璃等基板上制作微孔陣列，根據不同需求制作不同形狀的腔室，這些腔室具有無菌透氣、透明性、低毒性等特點以滿足單細胞的培養與代謝。例如，聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料具有疏松多孔、易于加工、生物兼容性好、透明 TC:jiuyi9follow8
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